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[摘要] 目的 研究CD4+CD25+調节性T细胞及转化生长因子-β1（TGF-β1）在血小板输注无效症（PTR）患者中的表达和意义。 方法 选取2017年4月～2018年4月广州市第一人民医院（以下简称“我院”）收治的重症再生障碍性贫血（SAA）发生PTR患者34例作为为研究组。另取选取同期我院收治的SAA未发生PTR患者44例作为对照组。分别检测并比较两组患者CD4+CD25+调节性T细胞及血浆TGF-β1表达水平，并采用受试者工作特征曲线（ROC）分析上述两项指标在PTR中的诊断效能。 结果 输注前后研究组CD4+CD25+调节性T细胞表达水平低于对照组（P < 0.05），且研究组血浆TGF-β1水平低于对照组（P < 0.05）。经ROC曲线分析发现，CD4+CD25+调节性T细胞、TGF-β1联合检测诊断PTR的曲线下面积、敏感性、特异性高于上述两项指标单独检测（P < 0.05）。 结论 PTR患者CD4+CD25+调节性T细胞及TGF-β1水平均存在明显低表达，临床工作中可通过联合检测上述两项指标的表达情况，为临床PTR的防治提供参考依据。
[关键词] 血小板输注无效症;CD4+CD25+调节性T细胞;转化生长因子-β1;表达意义
[中图分类号] R457.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）06（a）-0080-04
Expression and significance of CD4+CD25+ regulatory T cells and transforming growth factor-β1 in patients with platelet transfusion refractoriness
CHEN Xiaojie YUAN Zhaohu YANG Xuexin YANG Huikuan LUO Shulan
Department of Blood Transfusion， Guangzhou First People′s Hospital， Guangzhou Province， Guangdong 5100180， China
[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of CD4+CD25+ regulatory T cells and transforming growth factor-β1 （TGF-β1） in patients with platelet transfusion refractoriness （PTR）. Methods Thirty-four patients with severe aplastic anemia （SAA） who had PTR from April 2017 to April 2018 in Guangzhou First People′s Hospital （"our hospital" for short） were selected as the study group. Another 44 SAA patients without PTR were selected as the control group. The expression levels of CD4+CD25+ regulatory T cells and plasma TGF-β1 were detected and compared in the two groups， and the diagnostic performance of the two indicators in PTR was analyzed by receiver operating curve （ROC）. Results The expression levels of CD4+CD25+ regulatory T cells in the study group before and after infusion were lower than those in the control group （P < 0.05）， and the plasma TGF-β1 level in the study group was lower than that in the control group （P < 0.05）. According to ROC curve analysis， the area， sensitivity and specificity of CDT+CD25+ regulatory T cells and TGF-β1 combined detection and diagnosis of PTR were higher than those of the above two indicators （P < 0.05）. Conclusion CD4+CD25+ regulatory T cells and TGF-β1 levels in PTR patients are significantly lower than those in control group. The expression of these two indicators can be detected in clinical work， which can provide reference for the prevention and treatment of PTR.
[Key words] Platelet transfusion refractory; CD4+CD25+ regulatory T cells; Transforming growth factor-β1; Significance of expression
血小板输注可有效治疗或预防由于血小板减少或血小板功能障碍所导致的出血，该治疗方式最早于1910年被应用于临床中，目前已得到飞速发展，是血液系统疾病的重要支持治疗手段[1]。然而，随着近年来相关研究的不断深入，越来越多的学者发现多次反复地使用血小板输注治疗可能会增加血小板输注无效症（PTR）发生的风险，不仅会延误患者病情，加重患者家庭以及社会的经济负担，同时会导致血小板资源的浪费[2]。迄今为止，导致血小板输注无效的具体机制尚未完全明确，但有学者[3]认为可能涉及遗传、免疫以及环境等多种因素，其中调节性T细胞在维持外周免疫耐受中起着至关重要的作用，其表达变化以及免疫抑制功能下降均可能导致了机体免疫调节机制的紊乱，进一步促进了PTR的发生。转化生长因子-β1（TGF-β1）是近年来所发现的一类新型的具有调节细胞生长与分化功能的TGF-β超家族成员之一，其可在免疫调节、细胞分化以及细胞凋亡等方面发挥极其重要的作用[4]。本研究通过探讨CD4+CD25+调节性T细胞及TGF-β1在PTR患者中的表达和意义，旨在为临床诊治提供数据支持。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2017年1月～2018年4月广州市第一人民医院（以下简称“我院”）收治的重症再生障碍性贫血（SAA）发生PRT患者34例作为研究组。纳入标准：①经血象、活检以及骨髓穿刺等检查确诊为重症再生障碍性贫血（SAA）;②连续接受ABO同型血小板输注2次无效，血小板计数未见明显提高，临床出血症状未见改善;③年龄≥18岁;④无临床病历资料缺失者;⑤输注24 h后血小板校正增加值降低者。排除标准：①合并其他血液系统疾病者;②伴有严重感染性疾病或免疫系统疾病者;③无法正常交流沟通或存在精神疾病者;④伴有恶性肿瘤疾病者;⑤正参与其他研究者。其中男20例，女14例;年龄18～67岁，平均（49.47±5.42）岁;病程2～55个月，平均（5.34±2.21）个月。另取同期我院收治的SAA非PTR患者44例作为对照组。纳入标准：①所有患者均经血象、活检以及骨髓穿刺等检查确诊为SAA;②年龄≥16岁;③无临床病历资料缺失者;④无发生连续血小板输注无效。排除标准：与研究组相同。其中男25例，女19例;年龄23～68岁，平均（50.12±5.37）岁;病程1～58个月，平均（5.27±2.19）个月。输注效果判断标准：输注24 h后以患者出血状况得到明显改善作为输注有效，并采用血小板校正增加值（CCI）作为量化判断依据，输注24 h后CCI>7.0×109/L均为有效，否则为无效;所有输注时患者均排除发热、感染、脾肿大等影响血小板数量的因素。所有血小板制品均来源于广州血液中心的机采血小板，每袋机采血小板容量约250 mL，含血小板数 ≥2.5×1011/L。两组上述各项指标比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。所有患者均已同意本研究，并签署了知情同意书，且本研究经我院医学伦理委员会批准。
1.2 研究方法
1.2.1 血小板输注 所有SAA患者均依照2000年版《临床输血技术规范》[5]输注血小板，根据患者血小板计数（×109/L）和临床出血症状决定是否申请输注血小板：>50×109/L，一般不需输注;>（10～50）×109/L，根据临床出血情况决定是否输注;<（5～10）×109/L，立即输血小板防止出血。血小板输注治疗：所有患者均输注ABO血型相匹配的单采血小板，每袋约为250～300 mL，每次输注1 U血小板，输注前静脉予以地塞米松5 mg（福州海王福药制药有限公司，生产批号：20161022，规格：1 mg/片），预防输血反应。同时根据血小板计数以及病情选择合理的输注时机，避免发热时输注。
1.2.2 标本收集 对照组输注前标本来自患者血小板输注前的配血标本，输注后标本选自血小板输注24 h后抗凝标本;研究组输注前标本来自发生PRT当次输注前配血标本，研究组输注后标本选自当次输注疗效评估抗凝标本。流式细胞仪检测CD4+CD25+调节性T细胞表达水平;采用酶联免疫吸附法检测血浆TGF-β1水平。相关操作均按照仪器（试剂盒）说明书进行。
1.2.3 试剂与仪器 CytoFLEX型流式细胞仪购自美国Beckman-Coulter公司;TGF-β1试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司（生产批号：180609）。
1.3 统计学方法
采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验;计数资料用率表示，组间比较采用χ2檢验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组CD4+CD25+调节性T细胞表达情况比较
两组输注前后CD4+CD25+调节性T细胞表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）;但研究组CD4+CD25+调节性T细胞表达水平低于对照组（P < 0.05）。见表1。
2.2 两组血浆TGF-β1水平比较
两组输注前后血浆TGF-β1水平比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）;但研究组血浆TGF-β1水平低于对照组（P < 0.05）。见表2。
2.3 CD4+CD25+调节性T细胞、TGF-β1表达水平诊断PTR的ROC曲线分析
经ROC曲线分析可知，CD4+CD25+调节性T细胞、TGF-β1联合检测诊断PTR的曲线下面积、敏感性、特异性高于上述两项指标单独检测（均P < 0.05）。见表3、图1。
3 讨论
PTR主要是指患者在连续接受2次血小板输注治疗，血小板计数仍无提高[6-8]。随着近年来血小板输注的开展日益广泛，PTR已成为目前临床亟待解决的难题之一。相关研究[9-10]表明，PTR的发生率为30%～70%，血小板表面含有复杂抗原、人类淋巴细胞抗原抗体等均是引发PTR的重要因素。其中反复多次输血时，由于异体间抗原系统的差异，刺激机体产生同种免疫反应，对外源性血小板产生抗体，是导致PTR的最重要免疫性因素[11-12]。CD4+CD25+调节性T细胞及TGF-β1均参与了机体免疫反应过程[13-14]，对上述指标与PTR的关系进行研究，可为临床PTR的防治提供参考依据。
TGF-β是一种分布广泛的免疫调节因子，在下调T细胞介导的免疫应答和控制自身免疫方面具有重要作用，尤其是在CD4+CD25+调节性T细胞发挥抑制效应中的作用引起人们的关注，但结论不一。目前有关TGF-β在诱导和维持CD4+CD25+调节性T细胞免疫抑制作用中的观点矛盾[15-17]：①有些实验支持TGF-β在诱导和维持CD4+CD25+调节性T细胞免疫抑制效应中发挥不可或缺的作用。②另一些研究则表明CD4+CD25+调节性T细胞的免疫抑制功能不依赖于TGF-β的存在。支持前者的依据是：活化的CD4+CD25+调节性T细胞表达高水平的膜表面TGF-β，通过与相应靶细胞的TGF-β以细胞间直接接触的方式而发挥抑制效应;本研究对这两个指标实施监测，结果表明输注前后对照组CD4+CD25+调节性T细胞表达水平高于研究组（均P < 0.05），提示PTR患者CD4+CD25+调节性T细胞存在明显低表达。外周血CD4+CD25+调节性T细胞占单个核细胞的1%～2%，占CD4+T细胞的5%～10%，在维持机体外周免疫耐受过程中起着至关重要的免疫调节作用[18-19]。而CD4+CD25+调节性T细胞可能是通过影响机体外周免疫耐受，从而降低血小板输注的效果，促进了PTR的发生。因此，可通过相关干预措施提高患者体内的CD4+CD25+调节性T细胞水平，从而达到提高血小板输注治疗效果的目的。此外，输注前后对照组血浆TGF-β1水平高于研究组（P < 0.05），提示血浆TGF-β1在PTR患者中存在显著低表达。TGF-β1可通过影响基质细胞血小板生成素所诱导的信号转导过程，尤其是降低促分裂原活化蛋白激酶、信号转导转录活化蛋白5以及胞外信号调节蛋白激酶1、2的活性，实现其抑制聚合细胞增殖的作用，并通过对T细胞以及单核细胞所具有的免疫调节作用产生不同程度的影响，进一步发挥促进机体免疫耐受恢复以及减轻血小板破坏的作用[20-22]。而随着TGF-β1表达的降低，机体免疫耐受受损加重，且血小板破坏程度增加，继而增加了PTR发生的风险。经ROC曲线分析可知，CD4+CD25+调节性T细胞、TGF-β1联合检测诊断PTR的曲线下面积、敏感性、特异性高于上述两项指标单独检测。提示了在临床工作中可联合检测上述两项指标表达情况，从而有利于评估临床血小板输注治疗效果，并为PTR的治疗提供了新的靶点和思路。
综上所述，PTR患者体内CD4+CD25+调节性T细胞以及TGF-β1水平均存在明显低表达，联合CD4+CD25+调节性T细胞与TGF-β1表达情况，有助于PTR的诊断。
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（收稿日期：2018-12-18 本文编辑：王 蕾）