对照组外周静脉血CD4+T淋巴细胞，提取RNA和DNA，检测CD4+T 细胞穿孔素基因启动子区域 DNA 平均甲基化水平以及穿孔素基因mRNA的表达。结果 COPD患者CD4+T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域DNA平均甲基化水平显著低于正常对照组（P﹤0.05），但穿孔素基因mRNA的表达较正常对照组增强（P﹤0.05）。结论 COPD患者CD4+T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域DNA低甲基化状态可引起穿孔素基因mRNA的过度表达，在COPD发病中具有重要的作用。
关键词：低甲基化；穿孔素启动子区；CD4+T 细胞；慢性阻塞性肺疾病
Abstract：Objective This study aimed at investigating the methylation status of perforin regulatory elements in CD4+ T cells from peripheral blood of COPD patients and its possible role in the pathogenesis of this disease. Methods The peripheral blood CD4+ T lymphocytes of eight patients with COPD and eight healthy controls were separated， and genomic DNA and RNA was extracted from the isolated cells. The methylation levels of perforin regulatory elements in peripheral blood CD4+ T lymphocytes were determined， expression of perforin investigated.Results The methylation levels in CD4+T lymphocyte perforin regulatory elements of patients with COPD were significantly lower than those in the control group， while the expression levels of perforin gene were relatively higher and the difference was statistically significant （P <0.05）.Conclusion Perforin regulatory elements of CD4+ T lymphocyte are hypomethylated in COPD patients， which activates perforin gene involoved in the development of this disease.
Key words：Hypomethylation； Perforin regulatory elements； CD4+ T cell； COPD
COPD是临床上非常常见的一种疾病，严重影响广大患者的身体健康。目前该病的发病机制不是十分明确，尤其是其肺功能不断恶化的特点还需要进一步研究。相关文献报导，自身免疫反应可能是该病不断进展的原因[1]；但具体到这种反应是如何形成和发展的还不太清楚。我们前期动物实验表明：CD4+T 淋巴细胞穿孔素基因启动子区低甲基化可促进穿孔素基因的表达，从而参与自身免疫性肺气肿的发生[2]；但该机制是否同样适用于被称之为自身免疫性疾病的COPD目前还不是十分清楚，有待进一步探讨。本研究以COPD患者为研究对象，通过检测CD4+T 淋巴细胞穿孔素基因启动子区域 DNA 平均甲基化水平以及穿孔素基因mRNA的表达，旨在探讨其在COPD发病中的作用。
1资料与方法
1.1一般资料 2014年2月～4月在我院呼吸内科病房选取经常规治疗达到稳定期的COPD患者8例，纳入COPD组；同期招募正常健康人8例，纳入正常对照组。COPD组患者均符合中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组制订的慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2013 年修订版）中的诊断标准[3]；其中，男性 5 例，女性 3例，年龄45～68岁，平均（56.4±7.8）岁。正常对照组男性 4例，女性4例，年龄40～58岁，平均（49.8±6.2）岁。两组年龄、性别差异无统计学意义，具有可比性。所有参加本次试验研究的对象均排除风湿性关节炎、过敏性哮喘、系统性红瘢狼疮（SLE）等常见免疫系统疾病。所有受试者均签署知情同意书，见表1。
1.2材料和方法
1.2.1主要材料 人外周血淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限公司），人CD4+T淋巴细胞分选磁珠（德国美天妮公司），亚硫酸氢盐处理试剂盒、质粒抽提试剂盒（德国QIAGEN公司），PGEM-T和PGEM-T Easy载体系统（Promega公司），M-MLV逆转录酶（Promega公司），dNTP（Generay Biotech公司）等。
1.2.2方法 外周血CD4+T 淋巴细胞分离、DNA、RNA提取、穿孔素基因mRNA表达测定以及穿孔素启动子区基因测序参照相关文献进行[4，5]。
1.3统计学处理 采用SPSS11.5软件包进行统计学处理，正态分布的计量资料以（x±s）表示，非正态计量资料以中位数（四分位间距）表示。采用t检验和秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
两组CD4+T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域DNA平均甲基化以及穿孔素基因mRNA比较：COPD患者CD4+T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域DNA平均甲基化水平显著低于正常对照组（P﹤0.05）；但穿孔素基因mRNA的表达较正常对照组增强（P﹤0.05），见表2。
3讨论
目前，专家们普遍认为，COPD患者尽管给予良好的治疗，但其肺泡损害一直不断发展；究其原因可能和其机体内存在的自身免疫反应有关。国外有学者研究发现：将自身免疫肺气肿大鼠脾脏中的CD4+T 淋巴细胞注入正常大鼠体内可诱发其出现肺泡隔细胞凋亡及自身免疫性肺气肿产生[6]，从而提示：CD4+ T淋巴细胞功能异常是肺气肿形成的重要原因。因为COPD的主要病理变化包括慢性支气管炎和肺气肿，所以我们推测该机制亦适用于临床上被称为自身免疫疾病的COPD。
Motz GT 等[7] 进一步研究证实：从长期被动吸烟的小鼠体内分离T细胞并转移到其他正常小鼠体内，后者会出现COPD样的疾病；所以，该研究进一步支持我们上述假设成立的可能。
DNA甲基化是一种化学修饰，在许多高等生物的生命活动中起到重要作用。甲基化常发生在启动子区CpG岛，DNA甲基化升高常抑制基因表达，反之则促进其表达。
我们的研究表明：COPD患者CD4+ T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域DNA平均甲基化水平显著低于正常对照组；但穿孔素基因mRNA的表达较正常对照组增强，结合我们前期动物实验得到类似结果[2]，我们认为：CD4+ T 淋巴细胞穿孔素基因启动子区低甲基化可促进穿孔素基因的表达，从而参与COPD的发生。究其具体机制，考虑可能和该区域低甲基化状态诱发的肺泡隔细胞凋亡有关[2]。
目前，促甲基化药物已在临床上广泛使用，无明显副作用。故本研究可望为临床上进一步探讨COPD的发生机制及寻求新的治疗方法提供思路。
参考文献：
[1]Taraseviciene-Stewart L， Douglas IS， Nana-Sinkam PS， et al. Is alveolar destruction and emphysema in chronic obstructive pulmonary disease an immune disease[J].Proc Am Thorac Soc，2006，3（8）：687-690.
[2]Zhang C，Yan MY， Lu P，et al. Hypomethylation of perforin regulatory elements in CD4+T cells from rat spleens contributes to the development of autoimmune emphysema[J].Respirology，2014，19（3）：376-381.
[3]中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2013 年修订版）[J].中国医学前沿杂志（电子版），2014，6（2）：67-80.
[4]肖嵘，李勇坚，陆前进，等.SLE患者T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域甲基化状态的探索[J].中华皮肤科杂志，2007，40（2）：89-91.
[5]李勇坚，肖嵘，李亚萍，等.SLE患者T淋巴细胞穿孑L素mRNA及其蛋白的表达[J].中华皮肤科杂志，2007，40（1）：57-58.
[6]Taraseviciene-Stewart L，Scerbavicius R，Choe KH，et al.An Animal Model of Autoimmune Emphysema[J].Am J Respir Crit Care Med，2005，171（7）：734-742.
[7]Motz GT，Eppert BL， Wesselkamper SC，et al.Chronic cigarette smoke exposure generates pathogenic T cells capable of driving COPD-like disease in Rag2 mice[J].Am J Respir Crit Care Med，2010，181：1223-1233.编辑/孙杰