摘要
[目的]探讨酶联免疫检测法在快速检测水产品孔雀石绿残留中的应用。[方法]应用一种酶联免疫试剂盒对市场抽取的43份水产品中残留的孔雀石绿和隐性孔雀石绿进行快速检测。[结果]水产品中孔雀石绿和隐形孔雀石绿检出率为6.98%。[结论]该快速检测法可用于大批量水产品的孔雀石绿和隐性孔雀石绿快速筛查。
关键词酶联免疫法；孔雀石绿；食品安全
中图分类号S851.34+7文献标识码
A文章编号0517-6611（2015）14-074-02
Abstract [Objective] The application of enzymelinked immunosorbent assay in rapid detecting malachite green residues in aquatic products were explored. [Method] The malachite green residues and implicit malachite green in 43 aquatic products were detected by enzymelinked immunosorbent assay rapidly. [Result] The detection rate of malachite green and stealth malachite green in aquatic products reached 6.98%. [Conclusion] The rapid detection method can be used in large quantities and implicit malachite malachite green aquatic rapid screening.
Key words ELISA； Malachite green； Food safety
孔雀石绿（MG）是一种带有金属光泽的绿色结晶体，属三苯甲烷类染料，作为杀真菌剂和消毒剂被广泛应用在水产养殖上[1]。孔雀石绿被鱼体吸收后会代谢为危害更大的隐形孔雀石绿（LMG）和隐形结晶紫（LCV），并沉积于脂肪组织，经研究发现孔雀石绿具有高毒、高残留、致畸、致癌、致突变等副作用，残留时间达到100 d以上，目前许多国家已禁用孔雀石绿。日本、美国、欧盟已不允许其作为兽药用于水产养殖上。我国在2002年在《动物性食品中兽药残留最高限量》（农业部公告235号）中将孔雀石绿列为禁用药[2]，在动物性食品中不得检出。但因其价格低廉，在水霉病防治方面尚未有很好的替代品，所以在水产养殖、运输过程中仍有违规使用，在不同程度上存在禁而不止的现象[3]。
随着科学技术的发展，检测水产品中孔雀石绿、结晶紫类物质的手段和方法多种多样，检测仪器越来越灵敏。常见方法有国家标准、ELISA试剂盒和胶体金试纸3类。2006年我国颁布了国家标准GB/T20361-2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》[4]，该标准方法的准确度较高，但检测步骤多，样品前处理繁琐、费时、检测成本高，使用有机溶液量大，仪器设备昂贵，不适于对大量样品进行低成本快速筛选、现场判定的需要。如何采用最快捷、最经济、最准确的检验方法，是食品安全的一项重要研究内容，就目前的发展趋势看食品安全检测方法首先要体现快速，因为食品生产者、经营者、监督者都需要准确而又及时的监控结果。鉴于此，笔者选用一种酶联免疫试剂盒分别对市场抽取43份水产品中孔雀石绿残留量进行了速测，旨在为水产品安全检测提供参考。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1仪器。
电子天平（瑞士梅特勒公司）、离心机（上海安亭仪器厂）、微孔酶标仪（美国宝特公司）、洗板机（美国宝特公司）、旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）、氮气吹干装置（瑞士Buchi公司）、离心管、微量移液器（单道20～200 μl、100～1 000 μl）。
1.1.2试剂。
乙酸乙酯（分析纯）、冰乙酸（分析纯）、正己烷（分析纯）、孔雀石绿隐性高浓度标准品（2.5 μg/L）、孔雀石绿ELISA检测试剂盒（力德力诺生物技术有限公司）。
1.2方法
1.2.1样品制备与提取。
水产品样品去除非食用部分，用匀浆器均质样品；称取（1.00±0.05）g匀浆样品至50 ml离心管中，加入10 ml冰醋酸-乙酸乙酯（1∶99，V/V）溶液，剧烈振荡2 min；室温下4 000 r/min离心10 min，取1 ml上层液于离心管中，加入氧化剂液50 μl，轻轻摇匀后室温避光放置3～5 min；40 ℃氮气吹干，吹干后立即加入1 ml样品稀释液，再加入1 ml正己烷，涡动20 s混匀，4 000 r/min离心5 min；去除上层有机相，取下层水相50 μl进行检测。
1.2.2酶标板操作。
取出所需的酶标板孔， 在每孔中加入50 μl工作标准品 （0、0.1、0.3、0.9、2.7、27.0 ng/ml） 和样品于所设定的孔中。 在每孔中加入50 μl抗体， 轻敲微孔板边缘1 min混匀。 25 ℃避光环境中反应30 min。
洗板4～5次， 每次应该加入250 μl 1倍洗液， 最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干。加入100 μl酶标物，轻敲微孔板边缘混匀，在25 ℃下避光培养30 min。重复洗板步骤，加入底物A液50 μl，再加底物B液50 μl，轻轻振荡混匀，25 ℃下避光反应15～20 min。加入50 μl终止液终止反应， 在450 nm波长下测定每孔OD值。
1.2.3样品加标回收率试验。用已检测的阴性样品做基体空白，取（1.00±0.05）g匀浆样品，分别加入0.1 μg/ml孔雀石绿标准溶液100、300、500 μl，每个浓度2个平行，采用该试验方法测定回收率。
2结果与分析
2.1孔雀石绿的标准曲线
结果表明，孔雀石绿含量（x，ng/ml）与吸光度之比（y=B/B0，%）的线性方程为：y=-22.889lnx+30.763，R2=0.998 7（图1）。
2.2样品中孔雀石绿检测结果
共检测样品43份，其中检出阳性结果样品有3份，残留量分别为2.137、1.581、1.439
μg/kg，检出率为6.98%。均超过水产品中孔雀石绿限量标准1.000 μg/kg。
2.3样品加标回收率
由表1可知，水产品中孔雀石绿的平均回收率为78.27%～88.73%，表明试验方法回收率稳定、可靠。
3讨论
样品检测如为阴性结果，可直接排除水产品中含有孔雀石绿和隐性孔雀石绿残留；如为阳性结果，需进一步用高效液相色谱法或液相色谱-串联质谱确证和定量。该试验中检出的3份阳性样品用高效液相色谱法确认后，均检出含有孔雀石绿残留。
ELISA试剂盒的所有试剂需要恢复至20～25 ℃保证灵敏度，吸附试验中溶液每次加量要严格相同， 酶标板洗板时确保干净， 甩干并在吸水纸上吸干后使用。
酶联免疫快速检测技术相对传统和经典的化学检测和仪器检测而言，其特点是检测所需的时间相对较少，对仪器设备、操作人员等条件要求不高，样品前处理简单，既快速方便又节约成本，可满足水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的筛选以及疑似样品的确证，应用前景广阔，有利于政府监管并指导企业自控，促进水产品卫生质量的提高，保护消费者身体健康，提高我国水产品的国际竞争力。
参考文献
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[4] 郑斌，赵红萍，冷凯良，等.GB/T20361-2006，水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定[S].北京：中国标准出版社，2006.
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单958，可见浚单0898较郑单958具有高产潜力的生理基础。
玉米子粒产量的90%以上靠叶片的光合产物，叶片光合产物的多少与叶面积指数正相关[6]。研究表明，玉米吐丝30 d后叶面积指数较高是高产的基础，因此在合理群体内，研究提高叶面积指数并延长较高的叶面积指数时间是高产栽培的方向。
（2）
品种不同，地上部分干物质积累差异较大，同一品种在不同生育期，地上部分干物质积累增长比例也不同，因此研究玉米地上部分干物质积累的动态变化规律，采取适宜的栽培措施，对指导玉米生产有重要意义。玉米子粒灌浆速率高，持续时间长，对增加千粒重有重要作用，因此选育高产品种，要研究其灌浆特性。
参考文献
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